最佳炮制工艺及验证

通过Design Expert8.0.6.（1）软件得到的三棱抗凝血炮制提取物最佳的炮制工艺为辅料选择为2，即9%米醋，蒸制时间为1.40小时，辅料比例为1.10g/mL，凝血酶初凝时间预测为11.6min。根据实际试验操作的方便性，选择最优的炮制工艺参数，称取药材10g,分三批，辅料选择9%的米醋，蒸制时间选择1.5小时，辅料比例为1.0g/mL。按最佳的炮制工艺进行操作，进行3次平行验证试验，并将预测值与实测值进行偏差计算，计算结果见表5。

讨论

传统的中医理论为，三棱生品具有破血行气，消积止痛的功能，可主治症瘕痞块，痛经，淤血经闭，胸痹心痛，食积胀痛。生品为血中气药，破血行气之力较强。古人相信三棱醋制后主入血分，破淤散结，止痛的作用增强。三棱的炮制沿革有，唐代的炮法（《产宝》）；宋代有煨制，醋制炙（《圣惠方》）；醋煮（《局方》）；元代有酒炒制（《丹溪》）；明清时期增加了蒸制（《本草汇》）；面煨制、乌头制（《普济方》）等的炮制方法。并《纲目》中有记载：“入药须炮熟，消积需用醋浸一日，炒或煮熟焙干，入药乃良”及《得配》的记载有“赤眼，毒眼，磨汁搽，蛇虎伤，为末掺，欲其入气，火泡（炮），欲其入血，醋炒”。现在主要的炮制方法有醋制，醋蒸，醋煮等。

在预实验中，将三棱生药与浸泡过米醋的三棱同时进行提取，与炮制后的药材相似，有与凝血酶，纤维蛋白酶作用，有明显的凝血酶初凝时间，但是可以得出三棱生药与米醋浸泡过的三棱的初凝时间较短，三棱生药的凝血酶初凝时间为5min，而浸泡过米醋的三棱的凝血酶初凝时间为6min。与炮制后的三棱凝血酶初凝时间相比，表明炮制后的三棱具有较好抗凝血作用。

本实验在单因素试验的基础上，采用Design Expert8.0.6（1）软件中的响应面法得到辅料选择，蒸制时间，辅料比例3个因素对三棱抗凝血的炮制工艺进行优化选择。从本次试验数据所绘制的三维效应面图可以看出，辅料选择对凝血酶的初凝时间影响较大，而辅料比例和蒸制时间对凝血酶的初凝时间的影响较小。对于这个最优炮制工艺预测得凝血酶的初凝时间为11.6min，这个预测值比单因素试验中一些实测值还小，可能是存在着因素间的相互作用，另一方面，在考虑实验室的实际情况下，有些实测值误差较大。

实验室使用的酶标仪型号为ELX800，按照设置好的模式，使用酶标96孔板进行测试，使用酶标仪进行一次测试需要的时间为45s左右，其中包括酶标仪的准备时间，因此使用酶标仪进行测定，设定的时间为每分钟测定一次，如此设定则无法得到精准的凝血酶的初凝时间，测定的误差较大。同时也需要考虑试验结果的其他因素，包括凝血酶的影响，酶反应的影响因素有很多，主要的有反应温度，反应环境，底物浓度，酶加入量等，在这次实验中，反应温度模拟人体温度，设定在37.0℃，反应环境为0.9%生理盐水，本实验试验的为凝血酶的凝血作用和三棱的抗凝血作用，以凝血酶的凝血时间为响应值，则需要凝血酶的加入量大于三棱炮制提取物的加入量。同时对于三棱炮制提取物的浓度，开始预实验使用的三棱浓度为0.1g/mL，使用酶标仪测定吸光度过小，测定误差较大，试验数据不可行，后调整三棱提取浓度为1g/mL，提高三棱酶标仪测定的吸光度。

查找过文献，发现三棱的炮制多是醋炙，醋炒，醋煮等，发现使用高压蒸锅对三棱进行高压蒸制炮制的较少，本次试验研究基于凝血酶的体外凝血过程，建立三棱抗凝血的体外试验，与体内抗凝血试验相比，试验周期短且试验成本较低，是一种更加简便的实验方法。