丹参酮IIA咪唑类衍生物抑制LPS诱导RAW264.7 NO、TNF-α的产生

炎症产生的时候，免疫细胞会作出一系列的反应，巨噬细胞则会分泌一系列的促炎症因子包括NO、ROS、TNF-α、和白介素等。但过度的炎症会对机体产生不利的影响诱发其他多种疾病。为了研究化合物TA20是否具有抗炎作用，我们研究了TA20对炎症介质产生的抑制作用。目的探讨TA20对LPS诱导NO、TNF-α表达的抑制作用。如图3-6 （A）所示，4小时8小时诱导组细胞形态学明显改变。对照组在形态上明显没有变化。随着药物浓度的逐渐升高，细胞形态学的变化不明显，说明该药物可能抑制LPS激活原264.7，并产生炎症反应。炎症模型诱导成功。不同浓度的TA20对RAW264.7有保护作用，可抑制NO和TNF-α的生成。TNF-α是一个最重要的促炎细胞因子它会诱导IL - 6的分泌，NO是一种强有效的杀灭病原物的炎症因子。不同浓度的TA20均能降低NO和TNF-α的产生,并且呈浓度依赖型。不同浓度的TA20治疗后图（B-C），LPS诱导的升高水平被抑制，与LPS处理的对照组相比，TA20显著抑制了促炎性介质的产生。这些数据表明TA20抑制了巨噬细胞内关键炎症介质的LPS诱导产生，而不影响细胞存活，说明TA20具有一定的的抗炎作用。

丹参酮IIA咪唑类衍生物抑制转基因Tg(fli1:EGFP)斑马鱼新生血管产生

本实验选取的斑马鱼为Tg(fli1:EGFP)品系，其用绿色荧光蛋白基因标记它的血管内皮细胞，在荧光显微镜下可以清晰看出斑马鱼体中血管的分布。斑马鱼的血液循环系统在不同发育阶段中发育成熟，如体节间血管在48 hpf时发育成熟，肠腔静脉在72 hpf时发育成熟，因此根据该特点观察加入药物后血管形态和数量的变化。如图3-8中(A)用0.64%DMSO(对照组)和0.5、1和2 mM TA09作用48h的72 hpf斑马鱼荧光图像，箭头指的是肠腔静脉。在图3-8中(B)是肠腔静脉随着TA09浓度改变的数量变化图。从图中可以看出，浓度组中的肠腔静脉数均比对照组的低，并且浓度组中肠腔静脉数随着TA09浓度增加而减少。浓度组数值与对照组相比，***p＜0.001，说明TA09可以抑制转基因Tg(fli1:EGFP) 斑马鱼中血管生成。

本文利用微波辅助合成技术，以传统中药丹参的脂溶性成分丹参酮IIA为母体，向其结构中的C环引入咪唑环，快速高效制备得到了3个丹参酮IIA咪唑类衍生物。然后采用电喷雾质谱技术，核磁共振分析技术对这3个化合物的结构进行了表征，同时利用并应用MTT法初步测定这些化合物的体外抗肿瘤活性，同时进一步利用划痕实验对化合物TA20抑制乳腺癌细胞的侵袭转移的能力进行评价。此外，通过LPS体外诱导炎症模型并通过ELISA、NO试剂盒、ROS荧光探针对TA20的抗炎作用进行评价。通过斑马鱼新生血管的变化对TA09进行评价本论文研究的结论如下：

(1) 应用微波辅助合成技术快速高效制备得到3个丹参酮IIA咪唑类衍生物，其均通过电喷雾质谱技术和核磁共振谱技术的结构确证。

(2) MTT实验的结果显示大部分丹参酮IIA咪唑类衍生物对MDA-MB-231高转移乳腺癌细胞、HeLa人宫颈癌细胞和Hep G2人肝癌细胞均具有抑制作用，且与母体丹参酮IIA相比，其抗肿瘤活性得到了显著提高，尤其是化合物TA12和TA20对MDA-MB-231乳腺癌细胞表现出良好的抑制作用，与吡柔比星的抗肿瘤活性相当。

(3) 同时分析了丹参酮IIA咪唑类衍生物TA20对MDA-MB-231细胞的侵袭转移的影响，结果显示化合物TA20明显地抑制了MDA-MB-231细胞的侵袭转移。

(4) 通过MTT筛选出化合物TA20的三个安全浓度，使用LPS体外诱导RAW264.7小鼠单核巨噬细胞产生炎症，使用ELISA、NO检测试剂盒、ROS荧光探针检测化合物TA20对TNF-α、NO、ROS产生的影响。

(5)化合物TA09作用转基因Tg(fli1:EGFP)斑马鱼，通过荧光显微镜观察转基因Tg(fli1:EGFP)斑马鱼的新生血管可知TA09抑制了转基因Tg(fli1:EGFP)斑马鱼新生血管的产生，我们觉得TA09可能通过抑制新生血管的产生进而对肿瘤细胞产生影响。

以上结果显示，所合成的丹参酮IIA咪唑类衍生物具有良好的抗肿瘤活性，且与母体丹参酮IIA相比，其抗肿瘤活性得到了显著提高，尤其化合物TA12和TA20对MDA-MB-231高转移乳腺癌细胞具有很好的抑制作用，且与吡柔比星的抗肿瘤活性相当。另外，通过体外诱导的炎症模型我们发现TA20可以抑制TNF-α、NO、ROS的产生，表明TA20具有一定的抗炎作用，TA09可以抑制斑马鱼新生血管的产生。