目的：建立稳定转染绿色荧光蛋白的乳腺癌细胞株，并通过磁珠筛选法得到稳定转染绿色荧光蛋白的乳腺癌干细胞，为后续乳腺癌干细胞分化研究奠定基础。

方法：碱裂解法提取绿色荧光蛋白 GFP，阳离子脂质体法转染乳腺癌细胞MCF7， 利用 G418 筛选得到稳定转染绿色荧光蛋白的 MCF7 细胞；利用免疫磁珠法分选稳定转染绿色荧光蛋白的乳腺癌干细胞，并用流式细胞术检测获得的乳腺癌干细胞。

结果：实验用阳离子脂质体法将从大肠杆菌 pEGFP-N1 中提取的质粒GFP 转染至MCF-7 乳腺癌细胞中，然后用含G418 的筛选培养基进行单克隆筛选，转染效率达85%-90%。免疫磁珠法分选 CD44+细胞，分选后 CD44+细胞比例为 99.57%，纯度很高， 可以与 CD24-细胞分选联合，进行乳腺癌干细胞的分选。

结论：利用以上方法可以得到稳定转染的绿色荧光蛋白的乳腺癌干细胞。

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碱裂解法提取绿色荧光蛋白GFP

本实验采用 DNA 抽提试剂盒，提取方法如下：取 4mL 大肠杆菌菌液，12000rpm 离心 5 分钟收集菌液，弃尽培养基。在沉淀中加入 250μL Buffer P1，彻底悬浮菌液。加入 250μL Buffer P2，温和颠倒离心管 5-10 次混匀。静置 4 分钟。加入 350μL Buffer P3，立即温和颠倒离心管 5-10 次,12000rpm 离心 10 分钟，将上清液移入吸附柱， 12000rpm 离心 1 分钟，弃滤液。加入 500μL Buffer DW1，12000rpm 离心 1 分钟，弃滤液。加入 500μL Wash Solution，12000rpm 离心 1 分钟，弃滤液。再次加入 500μL Wash Solution，12000rpm 离心 1 分钟，弃滤液。空吸附柱于 12000rpm 离心 1 分钟。将吸附柱放入一个干净的 1.5mL 离心管中，在吸附膜中央加入 50μL 超纯水，温室静置 2 分钟后，12000rpm 离心 1 分钟，保存管中 DNA 溶液。

乳腺癌细胞培养

人乳腺癌MCF-7 细胞[17]在含 10%胎牛血清的 RPMI1640 细胞培养液中培养，其内加入青霉素(100kU/L)及链霉素(100kU /L)，置于 5%CO2、饱和湿度、37℃的培养箱内[18]。

阳离子脂质体法转染乳腺癌细胞MCF7

转染前 1 天将 0.5～2×105 细胞......

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为了完成此次实验研究，我查阅了关于肿瘤和乳腺癌相关的文献。本实验采用免疫磁珠法，从 MCF-7 中分选出高纯度的 CD44+CD24-的乳腺癌干细胞亚群[20]，对其进行干细胞特性的检测。在免疫磁珠分选中，首先进行 CD24-细胞的分选，并用流式细胞术检测 CD24、CD44 的表达情况。分选后CD24-细胞的纯度高达 99.61%；分选后CD44+细胞的纯度高达 99.57%；故高纯度的BCSC 的获得是进行下一步实验的关键。在微球体培养实验中，分选后所得的 CD44+CD24-的细胞，在肿瘤干细胞培养基中能够形成微球体， 进行自我更新，BCSC 的获得为下一步实验奠定基础。