目的：课题组从药用植物中分离得到内生真菌NS，该内生真菌的次生代谢产物为红色，在前期工作基础上，进一步对内生真菌的次生代谢产物进行提取分离并初步摸索高效液相色谱法的条件，以期为后续含量测定打下基础。方法：内生真菌NS的次生代谢产物利用乙酸乙酯超声提取出天然色素，经过Borntragers反应和薄层色谱分析法的初步检视，再进行pH梯度分离和初步高效液相色谱法分析。结果：该天然色素可能含有羟基蒽醌类化合物，使用1%NaOH溶液处理粗提取物得出产物的高效液相色谱图较好，高效液相色谱法分析条件选择为检测波长302nm，甲醇与含0.3%甲酸的超纯水洗脱比例为40:60。

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方法

粗提取物的制备

取适量上述固体培养物用中药材粉碎机进行粉碎，后取出粉碎物过40目分样筛，用电子天平准确称取过40目分样筛的固体培养物样品10.00g于锥形瓶中，立即向锥形瓶中按1:20(g:mL)加入乙酸乙酯200mL，封口，在40℃下超声30分钟进行提取，抽滤得到提取液，滤渣再按上述步骤提取三次，直到颜色接近无色为止，合并滤液，将滤液进行减压旋转蒸发，在水浴45℃、冷凝器温度为-9.0℃、真空度为-0.10Mpa条件下减压蒸至100mL左右，转移至250mL旋蒸瓶继续进行减压旋转蒸发，蒸干得到粗提取物，刮取出后，放置样品瓶中，将装好粗提取物的样品瓶放置于45℃的烘箱内进行干燥，干燥成粉末状备用。

粗提取物的初步检视

Borntragers反应

羟基蒽醌类化合物遇碱显紫红色，遇酸显红色，再次遇碱继续显紫红色。取适量色素粗提取物置于锥形瓶中后加入适量甲醇溶解，加入少量氢氧化钠溶液后记录颜色，加酸酸化后记录颜色，再加入氢氧化钠溶液后再次记录颜色。

薄层色谱法

向洁净干燥的两个层析缸中分别加入展开剂1（甲醇：三氯甲烷=1:1(v/v)）和展开剂2（甲醇：三氯甲烷=7:3(v/v)）进行预饱和处理，取适量色素粗提取物置于烧杯中加入适量甲醇溶解，用毛细玻璃管取样后分别在两块在活化好的硅胶板上进行点样，后将点好样品的薄层板分别放入展开室的展开剂中，浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.5~1.0cm，密封室盖，等展开至规定距离（10~15cm），取出薄层板，晾干。喷显色剂（5%氢氧化钠溶液），晾干。

粗提取物的初步分离

由于推测该天然色素为羟基蒽醌类化合物，所以采用pH值梯度提取方法处理粗提取物，分别取1g三份天然色素粗提取物，分别置于烧杯中，标号1、2、3。向1号烧杯中加入50mL 5%碳酸钠溶液，向2号烧杯中加入50mL 1%氢氧化钠溶液，向3号烧杯中加入50mL 5%氢氧化钠溶液，使粗提取物完全溶解，分别抽滤，取滤液，分别加盐酸酸化，分别抽滤，取滤饼，干燥。分别记为产物1、产物2、产物3。