摘要：CRISPR/Cas9 是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas9 系统通过将入侵噬菌体和质粒 DNA 的片段整合到 CRISPR 中，并利用相应的 CRISPR RNAs（crRNAs）来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。

关键词：CRISPR/Cas9；基因编辑技术

1前言

20世纪80年代末期兴起的基因编辑技术是一种能够在分子水平上准确操作各种各样不同生物遗传分子信息的基因工程技术[1]，并且可以简单地和准确地编辑活细胞基因组。最常见的基因操作技术之一是同源重组(Homologous recombiation，HR)，是利用基因体外编辑技术将在体外设计好的目的基因导入到受体内，并与目的细胞基因组DNA同源序列进而重组，实现外来基因在目的基因内的定点编辑，从而使细胞基因组序列得到精确和特异性的编辑和修饰[2]，该技术编辑准确性好，编辑成功后目的基因可以随染色体共同遗传，并且可以使因为外源基因的导入使整合后的染色体基因组的不稳定性这一问题得到解决，成为人类研究生物基因多样性和解决自身基因疾病方面的重要手段[3-4]。但同源重组的基因编辑效率过于低下，不足1x10-6[5]，只能处于试验阶段，并不能大规模应用到各种社会生产工作中。随着深入研究基因编辑技术通过被人工合成的核酸内切酶介导后，越来越多的内切酶被发现，更加便捷的造成染色体断裂双链，激活自身修复机制，通过外源基因的插入使目的基因的表达沉默或基因片段的插入。本文就最新型基因组修饰平台CRISPR和Cas系统的发现、研究、作用方向、使用目的、应用方面和潜力等方面进行阐述。在2013年英国《自然》杂志和美国《科学》CRISPR技术分别被评为年度方法和年度十大突破之一。

2 CRISPR技术的发现与应用

2.1 新型基因修饰平台

 初次发现CRISPR序列是在大肠杆菌中，在1987年由日本科学家发现[6]，但当时因为科学研究水平的制约，无法认识到这段神秘间隔序列的功能，所以这个发现没有过多的得到人们的重视。直到1995年科学家对沃尔卡尼极嗜盐菌和地中海极嗜盐菌进行研究后再次发现相似的结构序列[7]。为了研究的更加方便，CRISPR序列被科学家在2002年将其正式命名。在2006年，美国科学家才认识到真核生物的RNA干扰与CRISPR系统相类似，于是科学家根据这一发现和猜想进行了相关的验证研究试验，然后CRISPR系统的功能被首度验证。CRISPR／Cas系统是由规律成簇的间隔短回文重复序列和Cas蛋白构成，是细菌在与噬菌体长期斗争压力下进化出的一种有效的获得适应性免疫机制，该防御机制是一种主动防御机制[8]，通过对CRISPR／Cas系统序列分析和细菌基因组研究，发现在古细菌和细菌基因组序列中存在大量CRISPR基因座[9]；CRISPR基因座主要由三部分构成，由一个前导区(Leader)、多个短而特别保守的重复序列区(Repeat)和多个间隔区(Spacer)组成。一般认为CRISPR簇上游是启动子序列，是富含AT长度为300～500bp碱基的区域。可形成发卡结构，含有回文序列一般认为是重复序列，重复序列区长度为21～48bp。长度为26～72bp的间隔区把重复序列隔离开来。Spacer区域由俘获的外源DNA组成，类似免疫记忆，其保护自身安全的原理是当有同样序列的外源基因片段入侵时可被细菌机体识别出，并使之沉默或进行剪切。一般在CRISPR簇的下游或其它地方分布着多达45个多态性Cas家族蛋白基因[10]，为了保证CRISPR区域功能的实现Cas蛋白与之共同成长进化形成一个高度保守的区域。Casl一Casl0等多种类型的蛋白是已经发现和证实的。Crispr/Cas具有多样性，因为CRISPR系统的间隔序列和Cas蛋白基因的多样性存在于各种古细菌和细菌基因组和序列中，所以Crispr/Cas具有多样性。因为作用机制中的差异性，所以现在比较公认的是CRISPR／Cas系统被分为三类[11]，即Type I、TypeII、TypeIII。目前最复杂的CRISPR／Cas系统是I型系统，其包含的Cas蛋白多达6个，在古细菌和细菌中都有发现，最主要的作用单元是Cas3蛋白，这种蛋白最具有代表性，该蛋白具有两种酶活性：DNA酶活性和解旋酶活性。I型系统系统中存在PAM区，在适应阶段识别外源DNA间隔区过程在表达阶段中PAM区功能得到体现，CRISPR相关病毒防御复合物Cascode复合体以及多个Cas蛋白与成熟的crRNA共同结合形成；在干扰阶段，为了成功引导Cas蛋白结合于靶位点进行特异性地切割，所以入侵的外源DNA与CASCAD在crRNA的指导下互补链配对形成R环结构[12]。II型CRISPR／Cas系统因其组分简单，是目前为止研究最深入投入精力最多，得到结果最显著的类型，结构简易而且发挥功能只需要Cas9蛋白、crRNA、tracrRNA、RNaseⅢ四种成分即可，其最大的特点是含有Cas9蛋白，中部的HNH核酸酶活性位点和N端的RuvC核酸酶活性位点是Cas9蛋白包括两个结构功能域，crRNA成熟和降解外源DNA都有Cas9蛋白参与其中。在II类型CRISPR／Cas系统中，CRISPR不仅能转录重复序列互补的反式激活crRNA(TtracrRNA)，也能转录产生Pre-crRNA......

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