制药工程文献翻译——摘要：本实验采用环境代谢组学的研究方法对蚯蚓提取物进行分析，蚯蚓代谢产物提取物的不稳定性在本实验得到了解决。本实验对两种常用的提取方法进行改进，在这两种提取方法中加入了热处理步骤并对其稳定性进行评估。采用主成分分析法和核磁共振光谱法对赤子爱胜蚓代谢产物进行分析。在对 Bligh 和 Dyer 两种常用的提取方法加入热处理步骤后发现提取物的代谢组学图谱变化最小，为蚯蚓提取物的代谢组学分析提供了一个更加完善方法。

关键词：赤子爱胜蚓；热稳定处理；代谢组学稳定性组织提取；核磁共振；组织萃取

1.介绍

陆地生态毒理学研究通常采用爱胜蚓属和蚯蚓属的蚯蚓进行代谢组学分析。对活体赤子爱胜蚓大量的内源性代谢产物进行分析, 并将活体蚯蚓新陈代谢数据进行直接比较和分析。此外，蚯蚓整体组织提取物的酶活性要比生态毒理学研究中所使用的其它物种的高很多。蚯蚓蛋白酶被认为对整体新陈代谢干扰有不确定的影响，而核磁共振的良好的重现性为之后的代谢组学研究提供了稳定的基础，在数据采集过程中要注意样本保存并防止样本氧化代谢，以此减少错误结果的产生。

目前为止的蚯蚓代谢组学研究中，对组织提取尚未有标准化方法，但几种常用的提取方法已被大多数研究者所认可。最常用的两种提取方法是经过改善的 Bligh 法和Dyer 法以及重水缓冲法。Bligh 和 Dyer 将氯仿、甲醇和水以特定的比例对内源性代谢产物进行极性和非极性的双相萃取。重水缓冲方法经过优化提取步骤变得更少，实验结果更加可信，同样可以提取出极性脂类的代谢产物。

在组织提取期间，所提取的酶活性改变可能是由于 NMR 时样品发生降解导致的， 通过选择性加热可以解决酶被激活的问题。本研究的目的是对 liebeke 和Bundy 的研究进行验证，对二人所得到的提取流程参数对实验影响进行评估，其主要为提取物的过滤和加热对所制备的 NMR 样品的稳定性影响。具体实验方法是采用 70%乙腈对提取物采用四种不同的提取方法进行提取并对所得到的代谢产物稳定性全面的测定。在这项研究中，我们深入评估了两种最常用的提取技术，既核磁共振分析极性提取物的稳定性以及不同加热时间对提取过程中的核磁共振样品的稳定性的影响。

2.方法

2.1对赤子爱胜蚓的培育

对赤子爱胜蚓的生长和其幼虫生长培育的一系列相关细节可以从补充材料中查得。

2.2代谢产物提取以及稳定性研究

2.2.1提取

对培育出的赤子爱胜蚓幼虫采用改进后的 Bligh 和 Dyer 法并以氯仿/甲醇/水（CMW）三者按一定比例混合为流动相和重水缓冲法进行提取。实验流程经过如下述。

2.2.2CMW

将 0.025 克冻干的蚯蚓放入试管并加入冷的甲醇（22.2 毫升/克干重（克））和水（8.9 毫升/克）。蚯蚓湿质量包含约 82%水。该混合物使用 precellys 24 均质机在 108.3 赫兹用采用粉碎 15s 之后停止运行 15s 的两个循环粉碎过程。将匀浆转移至含有冷氯仿（22.2 毫升/ GDW）和水（11 毫升/ GDW）的玻璃小瓶中，使 CMW 提取液与冷氯仿和水的的容积比为 2：2：1.8。将所得物混合均匀，并在冰水中冷浴 10 分钟。通过在 4℃离心 5 分钟使溶剂相分层，并用......