本课题组在实验前期的研究中发现葫芦茶具有较强的抗过敏性哮喘作用，但是目前其作用机制还不清楚。因此，本实验是为了验证葫芦茶抗过敏性哮喘的可能有效组分，首先采用中压液相色谱法和高压液相色谱法，对葫芦茶叶提取物进行了多组分富集，富集得到了 10 个组分。然后对富集得到的 10 个组分采用无标记整合的实验方法进行筛选，通过用敏喘宁脱敏实验检验 GPR35 受体的激动活性，结果显示各组分对GPR35 受体均有不同程度的激动活性，其中组分 Fr5 和 Fr6 对 GPR35 受体激动剂敏喘宁的脱敏活性最为明显，因此。由这个实验结果可以推测出组分 Fr5 和组分 Fr6 可能是葫芦茶抗过敏性哮喘的有效组分。

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葫芦茶的提取与分离

（1）提取：采集新鲜的葫芦茶植株在放置一段时间后，将葫芦茶植株叶子放置干燥的阴凉地，待植株阴干至恒重之后，用电子天平称取葫芦茶的叶子部分 0.91kg， 将其粉碎，然后用 95%的乙醇在 70℃水浴的条件下，回流提取 3 次，每次回流 2 小时，然后收集提取液，然后将收集到的提取液集中到一起，然后用旋转蒸发仪挥发， 去除提取液中的乙醇，最后得到葫芦茶叶浸膏 110g。

（2）萃取：将得到的葫芦茶浸膏 110g，溶解在 70%的甲醇中，甲醇 2L，然后用正庚烷萃取 3 次，每次使用正庚烷体积为 2L，然后分层，分别是甲醇水层和正庚烷层。甲醇水层用旋转蒸发仪蒸发，除去其中的甲醇和水，得到葫芦茶的浸膏并且冷冻干燥浸膏，最后得到葫芦茶提取物的干燥粉末 55g。

（3）中压液相洗脱：将葫芦茶提取物的干燥粉末 55g 溶于 500ml 的纯甲醇中， 加入 55g 的 C18 硅胶粉末，充分搅拌，待其混匀之后用旋转蒸发仪蒸发去除甲醇， 得到葫芦茶提取物与 C18 硅胶的混合物粉末。以 95%的甲醇平衡预先制成的 C18 反向硅胶柱后，将混合粉末装填进 C18 反向硅胶柱中，依次使用 5%的甲醇，70%和 95%的甲醇洗脱，每个浓度洗脱 3 个柱体积，分别回收洗脱液，重新对洗脱液进行旋转蒸发并冷冻干燥，得到干燥粉末。回收所得到的 70%的甲醇洗脱液的干燥粉末的质量为25.6g。

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葫芦茶馏分的激动活性分析

敏喘宁是 GPR35 的强效受体激动剂，我们检测了不同浓度梯度的敏喘宁对人直肠癌细胞激动活性，以动态质量重分布响应值作为敏喘宁激动活性的检测标准，结果如图 3.1 所示，在敏喘宁浓度大于 1μM 时，其对人直肠癌细胞激动活性没有随敏喘宁浓度的增加而显著提高，据此我们选择 1μM 的敏喘宁作为本实验阳性对照。利用无标记细胞表型分析法，我们检测了 25μg/ml 的葫芦茶组分对人直肠癌细胞的动态质量重分布信号相应，选取 60min 内取最大动态质量分布信号值为葫芦茶组分的激动活性指标。从图 3.2 可以发现，葫芦茶组分 Fr4，Fr5，Fr6，Fr7，Fr9，Fr10 对 HT-29 的动态质量重分布响应信号强度均在 300pm 以上，大于 1μM 浓度的敏喘宁对人直肠癌细胞细胞的激动活性，表现出较强的激动活性。

为了进一步检验葫芦茶组分对 GPR35 受体的激动活性，我们利用葫芦茶组分Fr4，Fr5，Fr6，Fr7，Fr9，Fr10 对人直肠癌细胞预处理 1h 后，重新建立 2min 平衡基线，再加入 1μM 的敏喘宁，监测了预处理后的......