培养方式

将纯化后的的原生质体稀释密度为2×105个/mL，分别对其进行液体浅层培养、琼脂糖包埋培养、固液双层培养及海藻酸钠培养四种培养方式进行考察。培养条件为26±2℃、黑暗培养，具体操作如下：

液体浅层培养：取0.5mL密度为2×105个/mL的原生质体悬浮液，接种在培养瓶内，用Parafilm封口，放置培养箱内培养，每5天进行一次镜检，用碱渗液进行密度的调节。

琼脂糖包埋培养：实验前，将1.2％的低融点琼脂糖加于MS液体培养基内，高温高压灭菌后冷却待用。实验时，将灭菌好的琼脂糖微波炉热1min，使之完全溶解，放入40℃恒温水浴锅内恒温；将纯化好的原生质体调整浓度为4×105个/mL的原生质体悬浮液；取出琼脂糖，与原生质体悬浮液等体积混匀，移至于培养皿（3cm）中培养，待其冷却凝固后，用Parafilm封口，至培养箱内培养。

固液双层培养：实验前，将1.2％的低融点琼脂糖加于MS液体培养基内，高温高压灭菌后冷却待用。实验时，将灭菌好的琼脂糖微波炉热1min，使之完全溶解，倒至已灭菌好的培养皿（6cm）内，放凉备用；将纯化后的的原生质体稀释密度为2×105个/mL，吹打均匀，加入至已放凉凝固了的琼脂糖的培养基表面（1mL/个），用Parafilm封口，放培养箱内培养，每5天镜检一次，根据情况加入不同量的已灭菌好的碱渗液（培养液-甘露醇）。

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根据图2：培养密度在图中显示出在实验的密度范围内，分裂频率及植板率均出现先上升后下降的趋势，在2×105个/mL的培养密度达到分裂频率及植板率的最高值，观察发现此密度下培养，不出现褐化情况。一般来说，原生质体有其最适的培养密度，培养密度过低，抑制其生长分裂，培养密度过高，其过分的堆积也会抑制其生长，且培养密度过高，后期积累的代谢产物也会增多，对原生质体的培养影响较大。

采用2×105个/mL的培养密度去进行广藿香原生质体的培养的效果最佳。

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不同培养方式对植物原生质体培养的影响

理论上，液体浅层培养操作简单，对原生质体伤害小，有利于通气，在一定程度上，有利于达到最适密度，促进分裂，但同时极易过度聚集、相互粘连，导致原生质体的损害，很难持续分裂；固液双层培养，即承袭了液体浅层的优点，对原生质体伤害小，同时固液双层中的固体培养基有利于进行固液间的有害物质的交换，使液体培养基在有利于促进分裂的同时，也减少了有害物质的堆积；琼脂糖包埋培养可固定原生质体进行培养，有利于其进行观察，但琼脂糖凝固前的温度较高，会对原生质体造成一定的损害[14-15]；海藻酸钠包埋，常温下包埋，免除了温度对原生质体的损害，但形成海藻酸钠微球，需海藻酸钠与钙反应，这可能会导致渗透压对原生质体形成伤害。从......